标签：生物反应器 成纤维细胞 科普 胰蛋白酶
实验前准备和实验方法
1.动物和试剂
野生型 C57BL/6 小鼠。以下抗体用于免疫细胞化学：抗肌节 α-肌动蛋白 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、抗心肌肌钙蛋白 T 和抗肌球蛋白重链 小鼠单克隆抗体和豚鼠单克隆抗波形蛋白抗体。除非另有说明，试剂品牌选用Sigma。
2.小鼠 ES 细胞培养
维持在α-肌球蛋白重链启动子控制下表达EGFP的小鼠ES细胞 。R1 ES 细胞普遍表达 EYFP、在 α-肌球蛋白重链启动子和潮霉素抗性基因上游的磷酸甘油酸激酶控制下的新霉素磷酸转移酶基因，进行维持。
3.生物反应器系统
生物反应器培养系统采用使用1L左右的台式细胞培养生物反应器。该生物反应器配备有温度传感器、PH控制系统、和溶氧度感应系统,，以及补料、收获和样品端口。数据采集及过程控制均采用微电脑自动化控制，生物反应器内部的空气、氧气或氮气将溶解氧维持在40%左右为宜。通过 CO 将 pH 值保持在 7.22培养基呈碱性时加入；当介质呈酸性时，不调节 pH 值。温度保持在37°C。使用带有 CCD 相机的运动分析显微镜记录容器中 EB 的流动。也可以在 CO2 培养箱中使用配备不调节条件的传感器的容器作为对照。
(上图为：生物反应器系统中培养基中溶解氧浓度对细胞增殖和心脏分化的影响)
4.生物反应器培养
对于检查心脏分化功效的实验，我们使用 100-ml 或1L细胞罐培养 EMG7 ES 细胞，在生物反应器中添加 10% FBS、非必需氨基酸 (Invitrogen) 和丙酮酸钠的格拉斯哥必需培养基 (Invitrogen)。胰蛋白酶消化后，将 1×10 7 个mES 细胞重新悬浮在 100 ml 分化培养基（1×10 5 个细胞/ml）中，并接种到 100-ml 搅拌生物反应器中。第3天，收集培养在容器中的EB，在相同条件下重新接种到4个新容器中，每天*更换培养基（100 ml/天）或连续更换（100 ml/天）。
（下图为：生物反应器系统中叶轮搅拌速度对细胞增殖的影响）
用于收集心肌细胞以创建细胞片，1×10 7使用 100-ml 或 1-L 培养容器培养 R1 mES 细胞，DMEM 补充有 15% FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠和 L-谷氨酰胺 (Invitrogen)。对于 100 ml 培养，第 3 天容器中的 EB 在相同条件下重新接种到 4 个新容器中，每天*更换培养基（100 ml/天）或连续更换（100 ml/天） ）。对于 1-L 培养，在第 3 天将两个容器中的 EB 在相同条件下重新接种到 1-L 容器中，但搅拌速率除外（100-ml 培养，85 rpm；1-L 培养，65 rpm） . 连续更换培养基（1 L/天）。对于含有生长因子的 1-L 培养物，在生物反应器培养开始前 3 天到后 1 天用 Noggin (150 ng/mL) 培养细胞，从生物反应器培养的第 6 天到第 10 天用 GCSF (1 ng/mL) 培养细胞。在用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 解离 EB 后测量每个时间点的细胞数。对于心肌细胞的纯化，从心脏分化的第 10 天到第 18 天，将 400 µg/ml G418 添加到培养物中。在一些实验中，将 R1 ES 细胞培养在一个类似的 100-ml 生物反应器容器中，作为对照，在 CO2 培养箱中进行调节。
（下图为：心脏基因mRNA表达水平的比较）
5.流式细胞仪分析和荧光激活细胞分选
每个时间点的 EB 与 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 解离 30 分钟，并使用流式细胞仪分析 GFP(+) 细胞的百分比。对于细胞分选，可使用流式细胞分筛系统进行荧光激活细胞分选。EB5 mES 细胞用作阴性对照。
6.生化分析
每天从生物反应器培养系统收集培养上清液。使用生物传感器进行葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的测定。
7. RNA提取和RT-PCR
下一步按照基因学实验步骤进行总 RNA 提取和 RT-PCR 。定量PCR可使用朗基Q2000B进行PCR实验，实验条件为 94°C 初始变性 15 秒，而后 55°C， 30 秒和 72°C， 35 秒的 60 个循环，然后在 60-95°C 进行熔解曲线分析。使用 GAPDH mRNA 水平的标准曲线计算相对 mRNA 表达水平。对于每个基因，所有样品至少独立分析 3 次。
8.免疫细胞化学
细胞用 4% 多聚甲醛固定，进行免疫染色。再通过激光共聚焦显微镜、荧光显微镜和凝胶成像系统进行细胞免疫分析。
9.细胞分离
从新生小鼠（1-2 天龄）的心脏中获得心脏成纤维细胞。来自第4代的心脏成纤维细胞用于实验。免疫细胞化学分析显示>99% 的心脏成纤维细胞表达波形蛋白，不表达血管性血友病因子（内皮细胞标记）或 NG2（周细胞标记）。
10.细胞接种
将从成年小鼠分离的ES细胞衍生的心肌细胞和真皮成纤维细胞的混合细胞悬液以3.2×10 5 个细胞/cm 2接种到细胞培养瓶中，细胞在添加了15% FBS的DMEM中于37℃培养。培养 2 天后，使用细胞片堆叠操作技术收获细胞片并分层。
11.细胞片的组织学和免疫组织化学分析
为了观察多层细胞片的横截面，多层细胞片用4%多聚甲醛固定，并常规加工成3mm厚的石蜡包埋切片。通过常规方法进行苏木精和伊红（HE）染色和azan染色。
12.统计分析
数据表示为平均值±标准偏差。通过学生t检验或方差分析评估组间差异，然后进行 Bonferroni 校正以比较平均值。p <0.05的值被认为具有静态显着性。
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