实时定量PCR技术中常见问题汇总
实时定量PCR技术（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。它是一项临床上非常成熟的技术，目前在分子生物学领域，qPCR核酸定量的主要方法。目前仍在全球肆虐的病毒鉴定的“金标准"——核酸检测就是通过qPCR原理进行的。
那么拿到一个样本，需要经过以下多项操作流程才能定量检测到它的核酸含量。其中任何一个步骤操作失误都会导致它的检测结果出现异常！
1、无Ct值出现
a) 检测荧光信号的步骤有误：一般染料法采用72℃延伸时采集，探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
b) 引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。
c) 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
d) 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
e) 反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2、Ct值出现过晚
a) 扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。
b) 模板浓度太低：减少稀释度，重复实验。
c) 模板降解：重新制备模板，重复实验。
d) PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为100 bp-200 bp之间。
e) 反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，导致模板质量不高，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
3、阴性对照出现明显扩增
a) 反应体系组分（如水）被污染：实验过程中，更换新的Mix或者水重复实验。
b) 标本间的交叉污染或产物污染：反应体系在超净工作台内配制，对实验室进行严格的区分，减少气溶胶污染；使用带滤芯的枪头。
c) 引物二聚体的出现：引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
d) 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
4、熔解曲线出现多峰
a) 非特异性扩增。
b) 引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现。
c) 引物浓度不佳：适当调整引物浓度。
d) 退火温度低：提高退火温度。
e) 模板中有基因组DNA的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的污染（DNaseI处理），或通过设计引物避免非特异性扩增。
5、出现引物二聚体
a) 优化扩增条件，如提高退火温度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤)有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为60°C。
b) 引物浓度太高，适当降低引物浓度。
c) 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100 bp以下。
6、扩增效率低
a) 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
b) 反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法。
c) 反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。
7、实验重复性差
a) 加样体积失准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。
b) 定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
c) 模板浓度太低：模板浓度越稀，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
d) qPCR mix没有混匀，请使用前充分混匀。
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