培养基作为细胞的“食物"，是细胞培养和发酵的基础，大肠杆菌在不同的培养基中培养可能会表现出不同的性状，而利用这些性状的不同，可将部分菌种进行区分或分离，此外，根据目标菌种选择合适的培养基可以低成本、稳定的高表达。
大肠杆菌分离培养基常见的主要有以下几种：
大肠杆菌分离培养基：主要根据不同的大肠杆菌在培养基中的生产速度，代谢产物，对培养基中特定组分的需求利用情况不同等实现对不同种类的菌种进行分离或筛选。
LB固体培养基：是一种主要组分为酵母提取物、胰化蛋白胨、NaCl琼脂的非选择性固体培养基，通常用于细菌的培养。LB中加入的琼脂使培养基形成固体凝胶状态，细菌在其表面生长。向LB固体凝胶中添加特定的抗生素（如氨苄青霉素、卡那霉素等），可以选择性培养对该抗生素耐受的菌株并将非耐受的菌株去除，菌体对抗生素耐受的原因是由菌体质粒中含有抗生素抗药基因所赋予的。如：在制备大肠杆菌DH5α感受态细胞的过程中，添加氨苄青霉素的LB培养基可作为筛选含氨苄青霉素基因质粒的大肠杆菌。
伊红美蓝固体培养基（EMB）：是一种主要组分为蛋白胨，乳糖。磷酸氢二钠钠，琼脂伊红，美兰的用于大肠杆菌和产气肠杆菌的分离和鉴别的培养基，也适用于大肠菌群的分离培养，为弱选择性培养基。各成分的作用为：蛋白胨提供碳源和氮源；乳糖提供碳源；磷酸氢二钾是缓冲剂；琼脂是凝固剂；伊红（Eosin Y）为酸性染料：美兰（eosin-methylene blue）为碱性染料，二者在培养基中作为指示剂。当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电，被伊红染上红色，再与美兰结合而形成紫黑色菌落，带有金属光泽；若是产气肠杆菌形成棕色菌落，并很少有金属光泽；若是不能分解乳糖的细菌，如沙门氏菌和志贺氏菌，则形成无色或琥珀色半透明菌落；白色念珠菌形成蛛丝状或羽毛状菌落，凝固酶阳性葡萄球菌形成无色针尖大小的菌落。
麦康凯固体培养基（MAC）：是一种主要用来检验分离肠道菌的培养基，在药典中规定可以用于大肠杆菌的检测，在食品标准中可用于肠道致病菌的分离。培养基中胆盐及结晶紫对大多数革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，大肠杆菌因为可以发酵乳糖产酸，在培养基上菌落呈现为桃红色，并且菌落周围通常有明显的沉淀环，大肠菌群同样能发酵乳糖产酸，菌落也呈桃红色。致病性的肠道菌（如志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌等）因不发酵乳糖，菌落呈无色。此培养基由于对大肠杆菌的专一性较弱（大肠菌群和大肠杆菌的菌落特征比较接近），若样品中大肠菌群的含量比较高，分离大肠杆菌的效果较差。
大肠杆菌显色固体培养基（TBX）：利用酶底物法原理，对于大肠杆菌的分离和计数有高度的特异性，大肠杆菌特有的β-葡萄糖醛酸苷酶可分解培养基中的底物，使菌落呈蓝绿色，而大肠菌群和其他大多数杂菌通常呈无色或其他颜色，革兰氏阳性菌大多数不生长。在干扰菌较多的情况下，显色培养基的分离率远高于其它培养基。但是该培养基价格较高，有极少数大肠杆菌不产生β-葡萄糖醛酸苷酶（如肠出血性大肠埃希氏菌O157菌），因此不能显色。此培养基适用于食品、水、环境等检测。
哥伦比亚MUG固体培养基：利用大肠杆菌可利用β-葡萄糖醛酸苷酶特异性分解MUG，在紫外灯照射下发出荧光，该培养基特异性较强，极少数不产生β-葡萄糖醛酸苷酶的大肠杆菌不能发出荧光。此培养基没有选择性，多数杂菌均能生长，通常用于含菌量较少的水中的大肠杆菌计数。
VRBA-MUG固体培养基：在VRBA基础上添加了MUG，相比较于哥伦比亚MUG固体培养基，该培养基具有选择性，能够抑制革兰氏阳性菌的生长，大肠杆菌和大肠菌群可在此培养基中生长呈紫红色菌落，周围有沉淀环，因为添加了MUG，在紫外灯下照射时，大肠杆菌菌落可发出荧光，而大肠菌群则没有荧光。此培养基一般用于食品中大肠杆菌的检验和计数。
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