在细胞上做基因研究的一般的过程就是：利用CRISPR-Cas9先做基因除 (Gene Knockout) ，获得基因敲除细胞系纯合细胞：然后分析相关的生物学表型；最后做为对照还需要将原敲除的基因回补会到原细胞系中，做为对照细胞进行实验对比。而利用Cas9进行细胞敲除之后，细胞回补实验室要注意哪些问题? 特别需要考虑的技术原理是那些？如何规划好实验流程，下面我们就一步步的进一下细胞其因敲除和回补实验的效率/价格/周期等。
一、敲除细胞的方式
一般都是纯合基因敲除细胞，当然也可以选择MixClone的方式；纯合基因敲除，基本就是目的基因的所有的拷贝都被敲除，没有任何一个完整的基因拷贝可以起作用；这样的好处就是背景非常干净，做敲除最大的优势也得以体现，缺点就是效率较低，对细胞系要求较高，必须能够形成单克隆MixClone细胞敲除Cell Pool就是成本低，适合大规模筛选，从整体上看生物学表型的影响；缺点就是要看效果，有很多时候效果远不如纯合基因敲除，背景还在。
MixClone™极大地简化了基因编辑流程，周期短至四周，价格只有RNA干扰的一半；技术方法和严格的工艺流程控制，基因编辑效率可以高达80-95%，可直接用于下游基因功能分析。
MixClone™的技术流程
二、细胞基因敲除的方法选择
1. 细胞基因敲除策略一-移码敲除：
优点：设计简单，单gRNA就可以发挥作用，成本低；
缺点：鉴定麻烦，需要测序，难以保证一个基因有同样基因型，所以分析麻烦，要保证全都是非3的倍数的移码才能够保证基因敲除，所有很多细胞系是用移码做不到的(基因拷贝数多)。
2. 细胞基因敲除-Cas9X大片段基因敲除：
优点：鉴定简单，可以通过对敲除片段外部设计primer进行目的片段的扩增，同时所有的基拷贝都基本能够导入一致的基因缺失，功能分析简单；
缺点：技术复杂，需要有双gRNA对目的基因片段进行切割，而且要中间片段删除的克隆，成本高、效率较低，其次需要非常多的克隆分析才能有结果，需要更多的筛选克隆工作量。
总结:
移码敲除：是在外显子上切一下，导致非3的碱基缺失或者改变，从而实现整个外显子的蛋白序列的改变(但是对细胞有多染色体，多核现象的细胞，就是多个基因拷贝的细胞，这个基本无法去干净) ； 移码的gRNA作用在外显子上！
大片段敲除：就是在内含子设计一对gRNA，将非3整数的外显子整个片段的删除，或者是整个基因片段的删除; (除了技术复杂，贵点，什么细胞系都能用) ; gRNA一般在内含子上切。
三、基因敲除细胞系的构建策略
1. 通过病毒法稳转Cas9+gRNA获得基因敲除细胞系的流程: 构建载体+包病毒+转染+筛选+克隆+PCR【持续表达，周期长，成本高，效率高】。
2. 通过质粒法瞬转Cas9+gRNA获得基因敲除细胞系的流程: 构建载体+转染+克隆+PCR 【阶段表达，周期短，成本低，效率低】。
3. 通过Cas9X特有稳转获得的基因敲除细胞系的流程: 构建载体+转染+筛选+克隆+PCR【持续表达，周期短，成本低，效率高】。
4. 通过Cas9蛋白+gRNA获得基因敲除细胞系的流程: 转染+克隆+PCR【阶段作用，周期短，成本高，效率低】。
总结可以分为两类：持续的表达Cas9+gRNA与阶段性表达Cas9+gRNA两种。
四、基因回补实验的需要特别注意的问题
1. 一般都是cDNA的回补99%都是用cDNA来做回补，除非有钱的可以使用BAC大片段来做回补的 (可以考虑一下我们的VIRUS-Free技术)。
2. cDNA会不会被gRNA识别切割? 如果是Cas9持续表达的，而且gRNA是作用在外显子的肯定会!所以要特别注意做回补的时候，移码突变的必须要做cDNA突变(就是同义突变，将CRISPR识别的PAM序列去掉才行);要不回补的CDNA也会被切割破坏掉，所以我们不推荐做移码敲除是有原因的，前面省的钱后面再花回去。[注意：之前报道Cas9是可以编辑mRNA的，所以......移码除技术的问题后面比较复杂，很多人做回补实验没有检测到，这个也是其中原因之一]
Cas9X的所有大片段敲除的切割在内含子上，一般没有在cDNA上面有识别切割位点，所以回补实验就简单很多!
除此之外，Cas9X的核心技术还具备“0"偏差的将Cas9模块移除，有需要的科学家可以向我们提出，我们可以将Cas9模块在交付的敲除细胞株里面移除。是不是就更加的放心了?
3. 回补的鉴定问题?
要特别注意移码突变的过程中，有一定概率出现的WB背景杂带的问题比较麻烦? 回补之后的序列可能会干扰到回补片段的表达鉴定。
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