原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤

原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤
1、生长培养好的试验材料（一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片）
2、在拟南芥开花前取样（30片叶子左右即可）
3、切取叶片为0.5-1mm的细条（如果材料能达到每克107个原生质体，10-20片叶子需要5-10mL酶解液）
4、迅速将切下的样品转到酶解液中，要求全浸没。
5、黑暗条件下抽真空30min。
6、连续酶解，室温下23℃黑暗中静止酶解3h
7、利用光学显微镜检查原生质体（30-50μm大小）
8、在过滤前加入等量的W5溶液
9、洗干净滤网，并用W5润湿，之后过滤
10、离心100g，1-2min沉淀原生质体，尽可能吸走上清，重复洗2次
11、重悬原生质体于W5中，保持在2*105个/ml，冰浴30min。
12、100g离心2min，尽可能吸走上清，利用MMG重悬，浓度约2*105个/ml
13、加入10μL质粒（1000ng-2000ng）于2ml离心管中
14、加入100μL原生质体（2*104个），轻轻混匀。
15、加110μL PEG solution，轻弹使充分混匀
16、23℃室温孵育30min。
17、加400-440μL W5混匀，终止反应
18、100g，2min 23℃离心，去上清，重复洗一次
19、用1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养
20、20-25℃孵育16h以上
21、取样制片观察
 
溶液配制：
1、酶解液的配制（20ml）试剂终浓度质量/g

W5溶液配制（500mL）

MMG配制（100mL）

PEG配制（10mL）