实验室常用 DNA 聚合酶有三种：TaqTM ， EXTaqTM 和 Pyrobest TM DNA Polymerase。TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶， 保真性较差 ， 但价钱便宜， 一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM 是具有 Proofreading 活性的耐热性 DNA 聚合酶， 具有一定的保真性， 而且其扩增得到的 PCR 产物 3 ’ 端附有一个 “A" 碱基 ，如果希望直接将产物克隆 到 T-vector 可以用此酶 。 Pyrobest TM DNA Polymerase 也是具有 Proofreading 活性的耐热性 DNA 聚合酶， 其特点是保真性高，扩增得到的 PCR 产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。
1. 按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液：
TaKaRa TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方
Reagent | Quantity, for 50µl of reaction mixture |
10X PCR buffer （Mg2+ free） | 5 µ l |
MgCl2（25mM） | 如 TaKaRa TaqTM 加 3 µl |
如 TaKaRa EXTaqTM 加 4 µl | |
2.5mM dNTP mix | 4 µ l |
10µM Primer 上游 | 1 µ l |
10µM Primer 下游 | 1 µ l |
Template DNA | 1 µ l |
Taq 或 EXTaqDNA Polymerase | 0.25 µl |
Sterile deionized water | Up to 50µl |
Total | 50 µl /Sample |
merase 的配方
Reagent | Quantity, for 50µl of reaction mixture |
10X Pyrobest buffer | 5µ l |
2.5mM dNTP mix | 4µ l |
10µM Primer 上游 | 1µ l |
10µM Primer 下游 | 1µ l |
Template DNA | 1µ l |
Pyrobest TM DNA Polymerase | 0.25µl |
Sterile deionized water | Up to 50µl |
Total | 50µl /Sample |
① 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 20~50µl 以节约试剂；
② 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中；
③ 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 ~50µl 的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发；
2. 按以下程序进行 PCR 扩增。
PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异， 在实际操作中需根据具体的情况以及 PCR 结果而进行优化。
Step | Temperature, ° C |
Time, min | Number of cycles | Note |
起始变 性 |
94~95 |
1-3 |
1 | |
变性 | 94~95 | 0.5-2 |
25-35 | 退火温度比理论退火 温度大概低 5°C ，再 根据反应结果优化 |
退火 |
37-70 |
0.5-2 | ||
延伸 |
70-75 | 根据扩 增产物 的大小 | 每分钟延伸 1000bp | |
最终延 伸 |
70-75 |
10 |
1 |
反应结束后，抽取扩增样品 5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用 DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
澳门十大信誉网赌大全是一家专业从事实验室设备和耗材销售的公司，为科研机构、医院、生物制药公司和生物科技企业等提供一站式的实验室解决方案。作为澳门所有的游戏网站大全生物的供应商之一，朗基PCR仪系列涵盖了荧光定量PCR仪、快速PCR仪、高通量PCR仪和梯度PCR仪、朗基 Q2000B 等多个型号，满足不同实验需求。更多的 PCR实验 设备报价和实验耗材采购服务请进入澳门所有的游戏网站大全我们将为您提供满意的实验室解决方案。
