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测序仪和PCR仪有什么不同?

 更新时间:2024-09-02 点击量:382

 测序仪和PCR仪是现代分子生物学实验中重要的实验室仪器,它们在基因研究和核酸检测等领域发挥着重要作用。虽然两者都与 DNA相关,但它们的功能和原理却大相径庭。测序仪和PCR有什么不同?

一、工作原理

1. PCR仪(聚合酶链式反应仪)工作原理

PCR仪的主要功能是进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR),这是一种在体外模拟DNA自然复制的过程。PCR仪通过控制温度变化,使DNA样本在以下几个阶段循环:

1)变性:将双链DNA加热至94-98℃,使DNA双链分离成单链。

2)退火:将温度降至50-65℃,使引物与单链DNA模板结合。

3)延伸:将温度升至72℃,DNA聚合酶开始沿着引物方向合成新的DNA链。

通过这三个阶段的循环,PCR仪可以在短时间内实现DNA的指数级扩增。

2. 测序仪工作原理

目前常用的测序技术是Sanger测序和二代测序(Next-Generation Sequencing, NGS)。

基因测序

Sanger测序(第一代测序技术)

  • Sanger测序是一种链终止法,其基本原理如下:

  • DNA模板准备:先需要将待测序的DNA片段克隆到适当的载体中,并通过PCR扩增出大量的单链DNA模板。

  • 测序反应混合物的制备:将DNA模板与四种不同的脱氧核糖核苷酸(dNTPs)、适量的DNA聚合酶和一种或多种带有不同荧光标记的链终止核苷酸(ddNTPs)混合。

  • 链延伸与终止:在DNA聚合酶的作用下,DNA链会不断地延伸。当链终止核苷酸(ddNTPs)被加入到正在延伸的DNA链中时,由于它没有3’羟基,无法形成磷酸二酯键,导致DNA链的延伸在此处终止。

  • 电泳分离:将测序反应产物加载到毛细管电泳仪中,通过电泳根据片段长度进行分离。由于链终止核苷酸带有不同的荧光标记,因此在电泳过程中会发出不同颜色的荧光。

  • 荧光检测与数据分析:电泳过程中,荧光检测器会记录下荧光信号,并生成测序峰图。通过分析峰图,可以确定DNA序列。


  • 二代测序仪

二代测序(NGS

二代测序技术包括多种不同的平台,如Illumina/SolexaRoche/454Ion Torrent等,它们的工作原理各有不同,但基本步骤相似。以下以Illumina/Solexa平台为例解释其工作原理:

  • 文库构建:将待测序的DNARNA片段化,并在片段两端添加特定的适配器( adapters ),通过 PCR 扩增形成测序文库。

  • 测序芯片加载:将测序文库加载到测序芯片上,每个芯片上有数百万到数十亿个独立的测序反应微孔。

  • 桥式PCR扩增:在微孔中,通过桥式PCR扩增,使每个微孔中只含有一个特定的 DNA片段的多个拷贝。

  • 测序循环:测序循环包括以下几个步骤:

  • 加碱基:向微孔中加入四种不同的荧光标记的核苷酸,但它们不含有链终止基团。

  • 成像:检测并记录每个微孔中的荧光信号,对应于加入的核苷酸。

  • 化学降解:去除未结合的核苷酸和荧光标记,为下一轮测序循环做准备。

  • 数据分析:通过分析每个循环的荧光信号,生成原始测序数据。然后,通过生物信息学分析,将这些数据转换成DNA序列。

  • 二代测序技术因其高通量、高效率、低成本的特点,在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域得到了广泛应用。

    二代测序原理1


    二、PCR仪和测序仪的应用领域

    1. PCR

    PCR仪广泛应用于以下领域:

    1)基因克隆:通过PCR扩增目的基因片段,用于后续的基因克隆、突变等实验。

    2)核酸检测:用于病原体检测、遗传病诊断、法医学鉴定等。

    3)基因表达分析:通过实时荧光定量PCRqPCR)技术,研究基因表达水平。

    2. 测序仪

    测序仪应用于以下领域:

    1)基因组学研究:如人类基因组计划、动植物基因组测序等。

    2)疾病研究:通过全外显子组测序、全基因组测序等技术,研究遗传性疾病、肿瘤等疾病的发病机制。

    3)微生物研究:对微生物群落进行多样性分析,揭示微生物与环境的相互关系。


    PCR

    PCR和测序仪虽然都与DNA相关,但它们的工作原理和应用领域有很大差异。简而言之,PCR仪主要用于DNA的扩增,而测序仪则用于测定DNA序列。

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