葡聚糖基质凝胶过滤层析介质树脂填料

葡聚糖基质凝胶过滤层析介质树脂填料Smartdex G-10 蛋白分离

Smartdex G-10系列介质是一类以葡聚糖为基质的凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）介质，其工作原理主要是利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

  葡聚糖凝胶是一种具有三维网状结构的高分子化合物，它是由葡聚糖加入交联剂通过醚键互相交联聚合而成的，交联度越大,网孔结构就越紧密，吸水后的体积膨胀就越小，能允许进入凝胶内部的分子的分子量也就越小，反之亦然。层析时，大于凝胶孔径的大分子，被阻于凝胶相外，沿着凝胶颗粒之间的间隙走，下移速度最快,故最先洗脱下来，中分子物质部份进入凝胶内部，洗脱速度为其次，而小分子物质因全部进入凝胶，受到阻力大，故最后被洗脱下来，如此物质得到分离。

   型号G表明每克于凝胶吸水量的多少，例如G-10表明每克干凝胶吸水1.0克。这表征了凝胶所能膨胀的倍数，亦间接表征了凝胶孔径的大小。

表1.Smartdex G-10产品性能

2.装柱说明

2.1凝胶的预处理

Smartdex G-10 为于粉，初次使用前必须进行预处理。溶胀过程中严禁使用磁力搅拌，以免使微球破碎。

加入足够的水或缓冲液进行溶胀，室温3h 以上或水浴 90℃、1h。如果室温溶胀则需要进行真空脱气，然后将溶胀好的微球按照3∶1（v/v）加入水或缓冲液搅拌使其形成均匀的75%胶悬液。如果是重复使用的可以将 20%乙醇倾去，加水或缓冲液搅拌均匀成75%的胶悬液。

2.2 Smartdex G-10 的装填

2.2.1重力柱的装填

1）取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。

2）将溶胀好的介质混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的75%），打开下出口流干保护液。3）加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。4）装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。

5）装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4-30℃保存。

2.2.2 层析柱的装填

装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下∶

V=1.15mh

V∶所需介质体积 ml 1.15∶压缩系数r∶柱管半径 cm h∶装填高度 cm

注意∶介质实际体积占所取悬液总体积的 75%。

1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm 的去离子水。2）将填料悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。4）打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。（注意∶在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%）当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3 倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。5）关闭泵，关闭层析柱出口。

6）如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。

7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

葡聚糖基质凝胶过滤层析介质树脂填料Smartdex G-10 蛋白分离过程

3.1 缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm 或0.45 um 滤膜过滤。

平衡液为蛋白纯化后，用干保护蛋白的溶液（例如;PBS等），根据客户需求自行选择。

3.2 样品准备

样品在上样前建议离心或用0.22 μm 或0.45 μm 滤膜过滤，减少杂质，防止堵塞柱子。

3.3 样品纯化1平衡

上样之前，用平衡液至少平衡 5-10个柱体积，或直到基线稳定。含去垢剂的溶液可能需要平衡更长时间。2）上样和洗脱

推荐上样体积为柱体积的 10%以内。脱盐时最大样品量可至 30%柱体积。使用重力柱纯化时。待样品进入填料后，继续加入平衡液进行洗

脱，使用预装层析柱纯化时，可以通过上样管或样品环来上样。分管收集洗脱液，样品进入填料开始，按昭固定体积（例如 1ml/管）收集

样品，检测每管蛋白浓度和盐浓度，计算回收率和脱盐效率。预装层析柱纯化流速最高不能超过装柱流速的 70%。

凝胶过滤是一种非吸附性色谱技术，所有的样品物质都应在一个柱体积之内洗脱出来。完成一次操作后，如仍用同一种缓冲液，色谱柱不需要再平衡。3）再生

再生通常用水冲洗2 倍柱体积，然后用缓冲液冲洗2-3倍柱体积，如果不立刻使用，则用20%乙醇平衡后，4-30℃C保存。对不同的样品，建议大约5次循环后，采用完整的在位清洗（CIP）。

4.清洗及保存

在位清洗∶为除去变性蛋白或脂肪，有时需要对脱盐柱进行原位清洗。常用的清洗液为0.1-0.2 M NaOH 或非离子型去垢剂。

1）加入一倍的柱体积0.1-0.2 M NaOH，依靠重力或者低流速清洗介质。

2）用足够量的去离子水，冲洗介质，直至 pH 值至中性。

3）用至少三倍柱体积 20%乙醇溶液冲洗介质，然后做好色谱柱的密封，置于2-8℃保存。

注∶不建议介质多次重复再生和使用。

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